关键词：冷冻电镜、电子晶体学、单颗粒分析技术、电子断层扫描技术

冷冻电镜概念

冷冻电镜（cryo-election microscopy）是指采用冷冻电子显微技术和计算机三维重构技术相结合的方式¹，将含水生物大分子快速冷冻（>104℃）到液氮或液氮温度，并在低温条件下（~100 K）采用低电子剂量（如5 - 10 election/A2）成像，从而在高分辨水平上研究生物大分子的三维结构。由于生物大分子样品被冷冻的速度极快，样品内部的水来不及结晶而形成玻璃态的冰，从而避免了晶态冰形成时破坏生物分子样品的结构。这层非晶态的冰一方面可在电子显微镜中支撑样品，另一方面也可以在电子显微镜镜筒的高真空环境中很好地保存含水生物大分子样品中的水，从而更好地保护生物大分子样品，让其处于或接近于其生理活性状态，有效提高了分辨率²。冷冻电镜研究的对象小至几个纳米大小的单个蛋白质分子，大至整个病毒粒子，甚至是微米尺度的细胞器³。

冷冻电镜原理/结构解析方式

在冷冻电子显微学结构解析的具体实践中，依据不同生物样品的性质及特点，可以采取不同的显微镜成像及三维重构方法。目前主要使用的几种冷冻电子显微学结构解析方法包括：电子晶体学、单颗粒重构技术、电子断层扫描重构技术。

1、电子晶体学

利用电子显微镜对生物大分子在一维、二维以致三维空间形成的高度有序重复排列的结构(晶体)成像或者收集衍射图样，进而解析这些生物大分子的结构，这种方法称为电子晶体学。其适合的样品分子量范围为 10~500 kD，最高分辨率约 1.9 Å。该方法与 X 射线晶体学的类似之处在于均需获得高度均一的生物大分子的周期性排列，不同之处是利用电子显微镜除了可以获得晶体的电子衍射外还可以通过获得晶体的图像来进行结构解析。

2、单颗粒技术⁴ 

对分散分布的生物大分子分别成像，基于分子结构同一性的假设，对多个图像进行统计分析，并通过对正、加和平均等图像操作手段提高信噪比，进一步确认二维图像之间的空间投影关系后经过三维重构获得生物大分子的三维结构方法，如下图所示。其适合的样品分子量范围为80~50 MD，最高分辨率约3 Å。利用单颗粒技术获得三维重构的方法主要包括等价线方法、随机圆锥重构法、随机初始模型迭代收敛重构等方法，其基本目标是获得二维图像之间正确的空间投影关系，从而进行三维重构。

图. 单颗粒重构技术原理（利用不同投影角度的多个分子的显微放大二维图像进行三维重构获得三维模型）

单颗粒分析现已成为用来研究大的蛋白质复合物的有效方法，并且结合其他方法能够提供在（近）原子水平的结构模型⁵。

（2）能够处理异源的（不纯的或构象上多样的）材料。

（1）尽管理论上可以获得高分辨率，但是实际上通常难以达到。

目前，单颗粒分析还是一种低通量、专业性很强的方法：因为中等分辨率(~1nm)比较容易获得，所以这是一种研究大分子复合物很有前途的方法，并且与定量对接技术结合起来，为杂交方法提供了非常好的研究平台。

3、电子断层扫描成像技术

通过在显微镜内倾转样品从而收集样品多角度的电子显微图像并对这些电子显微图像根据倾转几何关系进行重构的方法称为电子断层扫描成像技术，如下图所示。该方法主要应用于细胞及亚细胞器，以及没有固定结构的生物大分子复合物(分子量范围为800 kD)，最高分辨率约 20 Å。

图. 电子断层扫描成像技术原理（通过获取同一结构不同角度投影的显微放大二维图像, 并利用这些图像以对应的投影角度在计算机中进行三维重构从而获得三维模型）

4、小结

资料来源：

[1]Frank J. Single-particle cryo-electron microscopy the path toward atomic resolution ) [M]. New Jersey: World Scientific, 2018.

[2]Bert W, Slos D, Leroux 0, et al. Cryo-fixation and associated developments in transmission electron microscopy: a cool future for nematology [J]. Nematology, 2016, 18(1) : 1 - 14.

[3]Beck M, Baumeister W. Cryo-electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail? L J_. Trends Cell Biol, 2016, 26(11) : 825 - 837.

[4]王宏伟.冷冻电子显微学在结构生物学研究中的现状与展望[J].中国科学：生命科学,2014,44(10):1020-1028

[5]Wolfgang Baumeister,吕柯,陈荣.冷冻透射电镜:从分子到系统[J].生命科学, 2010(3):4.DOI:CNKI:SUN:SMKX.0.2010-03-014.

作者：武瑾嵘

排版：壹   万

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