和义广业【行业分析】之无创血糖技术系列，本篇主要介绍无创血糖技术背景及无创测血糖技术之光学方法。
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糖尿病（Diabetesmellitus，DM）是一种因体内胰岛素水平异常引起的慢性代谢性疾病，其原因是胰岛素分泌不足，或体内细胞不能有效利用胰岛素。2019年国际糖尿病联盟（IDF）发布的全球糖尿病地图表明：全球有4.63亿糖尿病患者，中国糖尿病患者占其中的四分之一，约为1.298亿，居全球首位。根据IDF的估计，到2030年全球糖尿病患病人数将增至5.52亿，而到2040年将增至6.42亿。糖尿病可引发心、脑、肾、眼、足等多器官并发症，是继肿瘤和心脑血管疾病之后第3大威胁人类健康的重大非传染性疾病。
根据中华医学会糖尿病学分会（CDS）以及美国糖尿病学会（ADA）的建议，临床上对糖尿病的诊断标准主要有3种：空腹血糖≥126mg/dl（7.0mmol/L），75g口服糖耐量试验2h血糖≥200mg/dl（11.1 mmol/L），或有典型高血糖症状的个体随机血糖≥200mg/dl（11.1mmol/L）。目前治疗糖尿病的方案均为通过人为干预将体内血糖浓度维持在正常范围内（70～140mg/dl或4～8mmol/L），以有效降低并发症的患病风险。对于糖尿病的监测和护理，无论是前期饮食调节、运动，还是后期胰岛素替代疗法，均须提供精准的血糖浓度数据作为基本依据，血糖检测已成为糖尿病管理中不可或缺的一环。WHO建议糖尿病患者每天进行4～5次血糖浓度测量，ADA建议每天进行4～6次血糖测量，CDS建议每天监测4～7次血糖。由此可见，血糖检测已经成为涉及数亿糖尿病患者的重大需求。2019年发布的《美国糖尿病协会糖尿病诊疗标准》中，第一次把“血糖监测”作为与药物治疗同等重要的部分，设置独立章节，凸显了血糖检测技术的重要性1。
目前的血糖测量方法主要是生化血糖测量法（临床诊断）和有创血糖测量法（日常监测），目前技术已较成熟，也是目前血糖测量的主要方法。但此两种方法都需要采血检测，由于抽血或手指扎针取血会造成疼痛而且有感染的风险，还会引发心理上的恐惧与抵触。这就限制了测量血糖的频率，使糖尿病患者无法获得满意的血糖监测，因此迫切需要采取无创血糖测量技术来克服有创采血的缺点。无创血糖测量技术具有更加明显的优势：不会对人体造成痛苦和创伤，不会带来感染的风险，无需试纸等耗材，可长期使用，附加费用低，并且可以实现连续监测，有利于对糖尿病患者病情的更好控制。因此，近年来无创血糖测量技术成为血糖测量领域的研究热点。
无创血糖监测技术已成为一个国际性的研究课题和一种新的方法，无创血糖测量技术根据检测原理主要分为光学、微波、电化学、电阻抗和能量代谢守恒法，如下表所示。
近红外（NIR，680-2500nm）和中红外（MIR，2500-25000nm）具有相对理想的检测光谱。在近红外NIR光谱范围内，光具有相对较强的穿透生物液体和软组织（大于0.5mm）的能力，与紫外线（UV）或可见光比散射更少，可通过反射和透射光的吸收光谱实现血糖测量。基于中红外光谱的检测方法只能利用其反射光的吸收光谱，因为MIR光穿透组织的能力要弱得多（只有几微米）。通过透射光和反射光的吸收光谱上的葡萄糖吸收峰进一步定量推测出葡萄糖浓度。
人体组织内部结构复杂性以及各种物质光谱信息的叠加将极大地干扰结果的准确性，因此通常需要一些算法处理来提取所需的目标物质葡萄糖的信息。
有关研究3利用偏最小二乘法（PLS）和人工神经网络（ANN）建立了两种不同的抗干扰的校正模型，并通过对比分析得出结论，PLS模型具有更好的性能，验证均方根误差（RMSEP）较低，为0.419，相关系数（R）较高，为96.22%。后续团队实验就一步将RMSEP降低到0.061，相关系数增加到99.84%4。但是，该实验仅检测了小鼠及模拟皮肤组织，当样本人群（如年龄、肤色、性别、皮肤病等）不同时，算法模型对于不同个体准确性还需进一步研究验证。
通常，近红外的测量部位会选择在手指、耳垂、前臂、嘴唇、口腔黏膜等部位。但是在手指上的测量并不准确，而在嘴唇内侧的测量则相对较好。此外，葡萄糖仅占血浆的0.07-0.1%，组织或血液中的其他成分(包括水、色素、蛋白质等)同样会吸收一定的光，从而会干扰血糖的测定。因此，光源的波长需要选择在葡萄糖尽可能高特异性吸收的范围内。虽然已经有NIR/MIR光谱无创葡萄糖传感器成功商用的例子，但传感器的灵敏度和选择性、测量结果与实际值之间的相关性以及后续使用的算法都需要进一步的改进。
有关团队提出了新的光声测量方案5：即当脉冲激光（中红外MIR）照射到（热声成像则特指用无线电频率的脉冲激光进行照射）生物组织中时，组织的光吸收域将产生超声信号，这种由光激发产生的超声信号为光声信号。生物组织产生的光声信号携带了组织的光吸收特征信息，通过探测光声信号强度就能推算出葡萄糖浓度。该设备通过检测组织间液（ISF）中的血糖水平间接反映血液的血糖水平，可以连续测量90分钟，但与实际血糖值相比有15分钟的滞后时间，因为组织间液当前浓度反应的是15分钟前的血糖浓度。在90%置信水平下，葡萄糖浓度水平的不确定度为±30mg/dL。然而，在生理葡萄糖浓度范围内，检测灵敏度仍不理想。
另外，为了提高中红外光谱的选择性和灵敏度，有关团队6采用了表面增强红外吸收（SEIRA）光谱技术，但传感器仅在10g/L的纯果糖和葡萄糖水溶液中做了实验，验证了灵敏度和特异性得到了很好的提高，很难商用。
2 光学偏振法（OP）
光学偏振法（OP）是最早的无创血糖检测方法之一，因为葡萄糖是一种光学活性物质，具有稳定的旋光，当偏振光束照射含有葡萄糖溶质的溶液时，葡萄糖的存在会导致入射光的偏振面发生一定的旋转。此时，偏振方向将与原始入射方向形成一个偏转角，该偏转角与葡萄糖的量成正比。
偏振光通过样品后，也可以用偏振计测量偏振光的平面。当分析仪的偏振轴与电场的旋转角度匹配时，光电探测器将检测到最大的光强度。当偏振轴垂直于电场的旋转角度时，光无法被光电探测器检测到。
光学偏振的方法可直接用可见光检测，操作不复杂，容易获得结果，但该方法的精度不高。主要原因有以下三个：
（a）受被测物体散射特性的影响，偏振光容易失去偏振，人类皮肤具有很强的散射特性，而葡萄糖的光学活性几乎完全被真皮层的线性双折射所抑制，因此通常选择眼睛（尤其是前面的房水）进行血糖测量。但房水血糖值与实际血糖精准对应难度很大
（b）运动伪影可引起角膜双折射的变化。这种时变双折射是最重要的干扰源之一，它可以显著导致检测光偏振状态的变化，从而干扰葡萄糖的光学偏振特性。
（c） 当光束穿过皮肤并到达血液时，血液中具有旋光特性的生物分子（如维生素c和白蛋白）的存在可能会带来误差。
基本上有两种机制可以解决血糖监测偏振中角膜双折射的干扰问题：双折射补偿器和双波长偏振器7。有关团队人提出了一种双波长偏振葡萄糖传感技术，通过偏振法分别在635nm和532nm的波长处测量人工角膜内葡萄糖溶液的浓度。数据结果显示，平均误差降低至22.4 mg dL−1，线性相关系数为0.996。但是该实验仅进行体外葡萄糖溶液检测，没有进行人体试验，因此离临床应用还有很长的距离。此外，实验设备仍处于实验室样机阶段且操作步骤复杂，无法做到小型化并居家监测。
3 拉曼光谱
拉曼散射是光和分子发生相互作用时产生的。当分子吸收了入射光子的能量后如果没能满足电子能级共振条件，则分子会向一个虚态跃迁。处于虚态的分子不稳定，会迅速跃迁到更稳定的低能级，并产生一个光子，这个过程即为散射过程。产生的光子即为散射光。当某一频率的激光击中样品表面时，材料中的分子吸收部分能量，以不同的方式和程度振动，并散射出不同频率的光。频率的变化取决于散射材料的性质。不同的分子会产生特定频率的散射光。因此构成物质的分子类型可以通过拉曼光谱识别。基于拉曼散射，可定量分析葡萄糖浓度。与其它光学方法相比，拉曼光谱特异性更好，识别结果更准确。
基于拉曼散射，可定量分析葡萄糖浓度。与其它光学方法相比，拉曼光谱特异性更好，识别结果更准确。但葡萄糖的含量很低可能导致极其微弱的拉曼信号。此外，葡萄糖的拉曼光谱很容易被周围环境的强背景噪声掩盖8。
为了减弱周围组织产生的强背景信号的干扰，相关团队采用激光聚焦在皮肤血管等方法，已发表的研究结果显示：可以实现拉曼强度与血糖浓度大致呈线性关系且检测误差较小。但目前两个团队仅在小鼠皮肤和离体兔子眼部进行了初步动物试验2。
目前拉曼光谱血糖传感器在常规临床应用中面临的主要障碍是个体不同部位及不同个体是差异化的。肤色、皮肤厚度、基础代谢率和水合状态的差异经常导致不同个体和身体不同部位之间葡萄糖浓度的非线性差异9。
4 荧光法
4.1 原理
首先，分子通过弛豫过程从高能激发态衰变回基态并发射光子的过程称为辐射弛豫现象。辐射弛豫会产生荧光和磷光，人类血液中有大量荧光基团，当它们处于激发状态时可以发出荧光。荧光传感器不仅具有灵敏度高的优点，而且特异性荧光团的特征发射光谱保证了传感器的高特异性。
一些荧光材料，如量子点（QDs）和碳点（CDs），被用作葡萄糖检测的荧光探针。例如，GOx和葡萄糖之间的酶促反应产生的H2O2 会导致荧光猝灭。猝灭度表示葡萄糖的量，可由色度传感器在宏观水平上检测。
有关团队开发出了一种用于检测泪液中葡萄糖的纳米结构生物传感器10，显示了较高的相关系数。
有关团队开发了一款荧光比色传感器11。从宏观上看，在阳光和紫外光照射下，检测溶液的颜色随葡萄糖浓度的变化而变化，这是荧光比色传感器的基本原理。结果表明，吸光度比与葡萄糖浓度(10 ~ 500μM)呈良好的线性关系，相关系数R2为0.9944。此外，检测溶液的颜色在阳光下呈梯度变化。
但仅在实验室条件下，这些荧光传感器显示出更好的灵敏度和检测范围，因此只能做体外测试而不能在体测试。然而，荧光传感器的缺陷是显而易见的，因为它们通常只能测量体液，如眼泪和汗液，这些体液与血糖的相关性很差，并且还存在低信噪比、检测滞后和无法量化的问题。所以更适用于实验室研究。
5 光学相干层析成像（OCT）
光学相干层析成像（OCT）是一种新型的高分辨率成像技术。OCT提供了一种基于低相干干扰的深度定向层析成像功能。OCT信号的对比度源于生物组织或材料内光学反射（散射）特性的空间变化。它可以在不破坏生物组织完整性的情况下观察1~10mm深的生物组织内部微观结构，其空间分辨率可以达到10~15微米。OCT的显著优势是减少了其他因素造成的干扰，具有高分辨率、高信噪比、高穿透深度，不受血压、心率和红细胞压积的影响。
然而，OCT对于皮肤温度变化和移动很敏感、测量精度低、组织间液葡萄糖滞后、校准算法的通用性（个体化差异）和可重复性都是限制其发展的关键因素12。
有关研究显示13，糖尿病患者的血糖浓度与OCT信号斜率之间的相关系数为0.91，而健康志愿者的相关系数仅为0.78，这表明OCT技术在糖尿病患者中的检测能力和准确性可能优于健康人。
但另一团队研究表明14，组织结构多重散射的存在对分辨率有很大影响。此外，在高血糖情况下，衰减系数可能会受到红细胞变形的影响，因此可能不适合直接应用于人体。
6 光学方法总结
总之，光学方法的目标是直接通过各种光波对体内葡萄糖浓度的特定反应，而不是通过直接测量来估计血液葡萄糖水平。虽然通过光检测人体血糖可以实现无创性条件，但其无法应用于临床及商业化的根本原因在于测量值与实际血糖值没有太大的相关性，且线性范围窄，需要后续的算法进行校正。然而，个体之间存在很大差异，因此当前基于实验样本的算法模型不能完全适用于所有个体。此外，复杂的检测方法、苛刻的检测地点、繁琐的检测过程、对检测设备的高要求以及背景信号的背景干扰也限制了其作为家庭商用血糖仪的应用前景。
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