一、测序技术概述

测序技术指用于确定核酸、蛋白质、多糖等生物大分子的一级结构，较为常见的是核酸测序，确定核苷酸在核酸序列中的顺序，包括DNA和RNA测序，简单来说，就是将DNA/RNA分子中碱基ATGC的排列顺序显示出来。

测序技术的发展主要基于两个非常具有里程碑意义的理念：“生命是序列的”和“生命是数据的”，序列是基因组学最基本最重要的数据，也是生命科学领域大数据时代的核心组成部分。目前DNA测序已经从第一代DNA测序技术发展到第三代DNA测序技术，下文就DNA的三代测序技术进行简要说明。

（一）第一代测序技术

一代测序技术以Sanger发明的DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法(chain terminator sequencing) [1]和A.M.Maxam和W.Gilbert报道的DNA化学降解测序法(chemical degradation sequencing)为代表[2]，但由于化学降解法的程序复杂，后来逐渐被Sanger测序法代替。

基于DNA合成反应的Sanger法，又称为SBS法、末端终止法，于1975年由Sanger提出，并于1977发表第一个完整的生物体基因组序列。其核心原理是由于双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)的2、3位置不含羟基，在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有效放射性同位素标记的某种ddNTP（分为：ddATP，ddCTP，ddGTP 和 ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列[3]。

图. 一代测序技术[4]

（二）第二代测序技术

20世纪90年代中后期，第二代测序(next-generation sequencing，NGS)技术出现，随着NGS的发展出现了不同的二代测序平台。2005年，出现了第一个商用二代测序平台——454 Roche GS FLX[5]，该平台目前已经被淘汰；随后出现了Illumina（2006年）、SOLiD（2007 年）、Ion Torrent（2010 年）和华大基因的 BGISEQ （2013 年）。这些测序平台除了SOLiD是基于连接法测序 （sequence by ligation，SBL）外，其他平台都采用边合成边测序（sequence by synthesis，SBS）技术。

Illumina循环SBS法 (cycle SBS)也叫SBRT （Sequencing By Reversible Termination，可逆终止）的核心技术是DNA合成的可逆性末端循环，即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。其基本原理是将dNTP的3'-OH以叠氮基团RTG （Reversible Terminating Group，可逆末端基团）进行修饰；将4种碱基分别与不同的荧光分子连接；DNA合成时，RTG能起到类似于ddNTP的作用终止反应；每次合成反应终止并读取信号之后，洗脱RTG和荧光分子，进行下一轮循环[6]（详细内容可见往期《基因测序１——华大智造IPO，3分钟了解基因测序技术发展历程》）。

基因测序产业链主要包括上游基因测序仪等基因测序设备和配套试剂生产制造商、中游基因测序服务商和下游应用商（如图）。

图. 基因测序产业链[8]

基因测序的核心技术掌握在上游设备制造环节，目前处于国外垄断状态且进入技术门槛非常高，一般企业难以从上游设备制造环节切入市场。

据统计，目前二代基因测序设备主要被Illumina公司（HiSeq 2000、GA 2x、MiSeq、NextSeq测序平台）和Thermo Fisher公司（SOLiD、Ion Torrent和Ion Proton测序平台）占据，占比超过90%，上游基因测序设备制造已由国外公司形成垄断[9]。

截至2022年8月，我国已通过NMPA有效获批上市的基因测序仪产品有17款，涉及的公司包括武汉华大智造、苏州吉因加生物医学、重庆泛生子生物科技、杭州贝瑞和康基因诊断、广州市金圻睿生物科技、广州微远医疗、北京优迅医疗等，其中华大智造获批数量最多，合计4款，苏州吉因加和重庆泛生子次之，各2款。

（三）第三代测序技术

第三代测序在单分子水平读取核苷酸序列，因此也被称为单分子测序，主要技术路线有HeliScope的tSMS测序技术、Nanopore的纳米孔测序技术和PacBio的SMRT测序技术等等。与传统的第一代和第二代测序技术相比，第三代测序最大的优势是能够产生更长的碱基读长，除此之外，还能直接对RNA进行测序，无需逆转录，测序速度极快，同时其中某些技术所涉及的设备可以小型化，可便携至野外现场测序。但单分子测序技术的最大缺陷是错误率较高，需要通过多次测序来覆盖其高错误率。下表将单分子测序技术与前两代测序技术的各项参数进行比较。

表. 第一二三代测序技术比较[10]

三代测序仪目前多数为海外产品，国内企业正在布局研发。海外的三代测序目前主要有两家推出商用测序仪：PacBio的单分子实时测序技术和Oxford Nanopore的纳米孔测序技术。中国企业除了华大智造外，也有其他公司如齐碳科技、真迈生物等布局三代测序仪领域，除真迈的GenoCare 1600刚刚取证外，国内还没有其他取证的三代测序设备。

后文将对单分子测序技术进行深入的分析探索...

参考文献： 

[1] SANGER F，NICKLEN S，COULSON A R．DNA sequencing with chain—terminating inhibitors [J]．Proceedings of the National Academy ofSciences oftheUnited States ofAmerica，1977，74 (12)：5463—5467.

[2] MAXAM A M，GILBERT W．A new method for sequencing DNA [J]．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica，1977，74(2)：560—564．

[3] 孙海汐，王秀杰．DNA测序技术发展及其展望 [J]．科研信息化技 术与应用，2009，(3)．

[4] 图片来源：IVD资讯

[5] Margulies M, Egholm M, Altman W E, et al. Erratum: Corrigendum: Genome sequencing in microfabricated highdensity picolitre reactors.Nature, 2006, 441(7089): 120-120

[6] 乌日拉嘎, 徐海燕, 冯淑贞,等. 测序技术的研究进展及三代测序的应用[J]. 中国乳品工业, 2016, 44(4):5.

[7] 视频来源：医学仪器与试剂

[8] 资料来源：公开资料、火石创造

[9] 数据来源：国信证券

[10] 资料来源：《2017年中国基因测序产业图谱》，CNKI，国盛证券研究所

[11] TORRES T T，METTA M，OTTENWALDER B，et a1．Gene ex— pression profiling by massively parallel sequencing [J]．Genome Res． 2008，180)：172-177．

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作者：武瑾嵘

审核：李   芳