近日，日本高知大学的Hitomi Matsuura、爱媛大学Ryosuke Kawakami等人在国际权威期刊ACS Applied Materials & Interfaces（JCR1区TOP期刊，IF：10.383）发表题为 NIR-II-Excitable Dye-Loaded Nanoemulsions for Two-Photon Microscopy Imaging of Capillary Blood Vessels in the Entire Hippocampal CA1 Region of Living Mice 的研究。

双光子荧光显微(two-photon fluorescence microscopy，2PM)成像，其中荧光探针被组织穿透的近红外光(NIR，通常为700-1000nm)激发，能够以高时空分辨率对活体动物的深层部分进行可视化。2PM已成为生物学和生物医学中的标准光学工具。然而，提高2PM的可观察深度和时间分辨率（帧速率）仍然是一个重大挑战。例如，由于可观察深度有限，将2PM应用于小鼠脑血管系统的可视化主要局限于大脑皮层的I-VI层（距大脑表面<1mm）。这限制了对深部脑脉管系统的研究，如在记忆编码和调节以及某些疾病中的具有重要作用的海马体（>1.0mm）。

作者团队报告了一种荧光纳米探针乳液——基于戊二烯的染料分子(NIR-LipoPYF5，结构如图1所示)。这种探针在960nm激发处的双光子亮度比常用的血管造影剂罗丹明B−葡聚糖高出数十倍。在非常低的帧速率(≪0.1fps)下，使用这种纳米探针可以在没有NIR-II激光的情况下观察到深达1.6mm的小鼠脑血管，而罗丹明B−葡聚糖结合物只能达到0.7mm的深度。且随着探针在血管中浓度的增加，可见深度也随之增加。但达到一定的探测浓度后，观察到的深度会变得饱和，这表明960nm激光可能不会穿透深度超过1.6mm的组织。此外，尽管纳米探针在880nm激发下的亮度是960nm激发下的几倍，但在960nm光下可以看到比880nm光下更深的脑血管系统，即激发波长对观察深度也存在一定影响。

图1 将荧光探针（化学方法，左）与NIR-II激光（光学方法，右）集成的示意图。

II-VI表示每个皮质层。WM=白质，CA1=海马CA1区，DG=海马齿状回。

图4 NIR-LipoPYF5光子吸收和荧光波长结果

通过对活体小鼠（野生型，雄性，4周大）的脑血管系统进行NIR-LipoPYF5的效用2PM成像测试。将该乳液溶液(100μL)注入眼底静脉，然后在1100nm激发下对脑血管系统进行成像。采用共振扫描方法实现了30fps的高帧速率（每帧512像素×512像素，0.99μm像素-1），这不仅有助于避免由于体内水分子吸收激发光而造成的组织破坏，而且还能够直接获得血管动力学参数，包括血流速度或血管直径的变化。2PM图像的3D重建如图5a所示：

分别于注射后24小时和30天进行染色。比例尺：100μm。

除了肝脏之外，在大脑、心脏、肺、脾脏、肾脏或小肠中没有观察到明显的损伤或炎症。进一步研究了30天后NE6对小鼠的长期影响，发现在此期间肝细胞疾病恢复，即这种早期疾病，是可逆的，不是致命的。

作者团队合成了一种新的NIR荧光染料——NIRLipoPYF5，该染料整合了光学和化学策略，以提高2PM成像中的可观察深度和帧速率。这种染料在组织穿透(1100nm)激发时表现出足够高的双光子亮度(68GM)。当使用纳米探针和1100nm激光对小鼠脑血管系统进行2PM成像时，几乎整个海马区域（距脑表面1.1-1.5mm）的毛细血管以30fps的帧速率成功可视化。与报告的多光子成像技术相比，这种2PM成像方法在可观察深度和帧速率方面都有显著改善。另一方面，新的纳米探针在注射后24小时在小鼠肝脏中引起轻微的细胞紊乱，基本在30天内恢复。因此，纳米探针在肝脏2PM成像中的用途可能有限，但可以适用于大脑和其他主要器官（心脏、肺、脾脏、肾脏和小肠）。

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作者：易长城