和义广业【行业研究】之细胞转染行业研究分析，本文详细介绍了细胞转染的概念、转染的类型（如瞬时转染和稳定转染）、转染的技术路线（包括物理法、化学法、生物法及每类方法不同的细分路径），以及国内外代表厂商其转染业务板块中主要的转染试剂产品。本篇主要对细胞转染的概念、转染的目的/产出，以及转染的类型进行梳理分析。

关键词：细胞转染、瞬时转染、稳定转染、转化、转导

经过转染后，导入的核酸有可能暂时存在于细胞内，只在有限的时间内表达而不进行复制，也可能稳定存在并整合到受体细胞的基因组中，在宿主基因组复制时一同复制。

图. 不同的基因递送载体将核酸导入细胞中²

图. 脂质复合物介导的转染和内吞作用³

与转染这一递送系统类似的还是转化和转导（由于本文主要讲转染，转化和转导这两个名词的概念只做简单介绍），如下表所示。

转染的两个主要目的是产生重组蛋白或者特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。因此，转染是研究基因或基因产物功能和调控的有力分析工具，也可用于生产转基因生物以及作为基因治疗的方法：

· 基因表达

转染是使用质粒载体或 mRNA 在培养细胞（或动物模型）中表达目标蛋白的最常用方法。在真核细胞中进行蛋白表达可获得经适当折叠和翻译后修饰而具有目标功能的重组蛋白。此外，通过将具有易于检测的标记物和其他修饰的蛋白引入细胞中，可以研究启动子和增强子序列或蛋白间的相互作用。此外，采用各种转染策略可实现各种形式的生物制品生产。例如，重编程转录因子的递送能够生成诱导性多能干细胞 (iPSC)。另一方面，稳定转染可用于各种治疗分子的生物生产。

· 基因抑制

转染的另一个常见应用是通过 RNA 干扰 (RNAi) 抑制特定蛋白的表达。在哺乳动物细胞中，RNAi 通过内源性表达的非编码 RNA 以 microRNA (miRNA) 的形式发生，microRNA 来源于双链 RNA (dsRNA) 前体分子。前体分子被加工为成熟的 miRNA，后者成为 RNA 诱导沉默复合体 (RISC) 的一部分，RISC 的作用是抑制互补靶标 mRNA 的翻译。基于载体的系统可表达 miRNA 前体分子或短发夹 RNA (shRNA) 前体分子，经内源性机制加工后，可分别产生 miRNA 和 shRNA，随后发挥抑制基因表达的作用。这些系统可实现重组构建体的稳定转染以及前体分子的诱导型表达。化学合成的短/小干扰 RNA (siRNA) 也可被整合到 RISC 中，通过靶向互补 mRNA 进行降解，诱导基因沉默。对 siRNA 的修饰有助于防止脱靶效应以及确保 dsRNA 的活性链被装载到 RISC 中。

1、瞬时转染

在瞬时转染中，导入的核酸在细胞中存在的时间有限，且未整合到基因组中（如下图所示）。因此，在细胞分裂过程中，瞬时转染的遗传物质不会传递至下一代，而是在环境因素影响下丢失或在细胞分裂过程中被稀释。但是，当所转染的遗传物质在细胞中保持高拷贝数期间会引起高水平的蛋白表达。

根据使用的构建体不同，通常可以在 1-7 天内检出瞬时表达的转基因，但一般在转染后 24-96 小时收获瞬时转染的细胞。基因产物分析可能需要分离 RNA 或蛋白进行酶活性检测或免疫检测。最佳时间段取决于细胞类型、研究目标、导入基因的特异性表达特性以及报告基因达到稳态所需的时间。不过，在数天内，大部分外源性 DNA 会在核酸酶作用下降解或被细胞分裂稀释；一周后便无法再检出。使用超螺旋质粒 DNA 进行瞬时转染的效率最高，这是因为其能被细胞更高效地摄取。还可使用 siRNA、miRNA、mRNA 甚至蛋白质进行瞬时转染，但与使用质粒 DNA 一样，这些大分子需要具有高质量以及相对较高的纯度。转染的 DNA 易位到细胞核进行转录，而转染的 RNA 仍保留在胞质内，其可在转染 (mRNA) 后几分钟内表达。或与 mRNA 结合从而使靶基因（siRNA 和 miRNA）的表达沉默。

图. 瞬时转染

2、稳定转染

在稳定转染中，外源性 DNA 被整合至细胞基因组中，或者作为游离型质粒存在（如下图所示）。与瞬时转染不同，稳定转染可使外源性 DNA 长期存在于转染细胞及其子代细胞中。因此，稳定转染可以使导入的基因在多代细胞中持久性地表达，适用于重组蛋白生产和外源性 DNA 表达的下游或长期效应分析。但是，通常只有单个或几个拷贝的外源性 DNA 整合至稳定转染细胞的基因组中。正因如此，稳定转染基因的表达水平一般低于瞬时转染基因的表达水平。

由于外源性 DNA 稳定整合至基因组中是相对罕见的事件，成功完成稳定转染既需要高效 DNA 递送，也需要采取方法筛选已获得该 DNA 的细胞。要想筛选稳定表达所转染的 DNA 的细胞，最为可靠的方法之一是在用于转染的 DNA 构建体中纳入可筛选标记物，然后在短暂的恢复期后对细胞施加适当的筛选压力。

常用的可筛选标记物是可对各种筛选药物产生抗性的基因，或是可对待转染细胞系有缺陷的必需基因进行补偿的基因。使用选择性培养基进行培养时，未转染的细胞或瞬时转染的细胞最终都会死亡，而表达足够水平的抗生素抗性基因或能够补偿必需基因缺陷的细胞则可以存活。或者，在某些情况下，还可以将转染后的细胞的表型或形态变化用作可筛选的特性。例如，采用源于牛乳头瘤病毒的载体转染鼠 CI127 细胞，会造成细胞的形态变化（Sarver 等人，1981）。

虽然相对于超螺旋 DNA，使用线性 DNA 会导致细胞的 DNA 摄取量较低，但 DNA 整合到宿主基因组中的效果更优。通常，稳定转染限于 DNA 载体，但使用可筛选 DNA 载体制备短发夹转录本，亦可将 siRNA 和 miRNA 稳定导入细胞内，但是，RNA 分子本身无法用于稳定转染。

图. 稳定转染

3、小结

声明：以上根据公开资料整理。如有遗漏，欢迎留言补充。

作者：武瑾嵘

排版：壹   万